發(fā)布時間:2025-09-30 04:12:39 瀏覽次數(shù):1
離心技術(shù):
是分離純化蛋白質(zhì)、酶、核酸(DNA、RNA)、細(xì)胞的最常用方法之一。
電泳(electrophoresis):帶電粒子在電場中向著與其所帶電荷相反方向電極移動的現(xiàn)象。
可用于分離不同分子量的生物大分子。
1.蛋白質(zhì)的電泳:
用途:蛋白質(zhì)的定量。
2.核酸的電泳:
用途:用于核酸的分離、鑒定、純化、回收。
比如:我只需要長度300bp左右的分子。那么,電泳后,在切膠過程中,只切300bp處的分子即可。
蛋白質(zhì)研究相關(guān)的技術(shù):
1. 含量測定:
2. 結(jié)構(gòu)的測定:
(1)一級結(jié)構(gòu)的測定:搞清楚蛋白質(zhì)肽鏈的氨基酸排列順序。
方法:Edman降解法、質(zhì)譜法(MS, 將蛋白水解,多肽鏈分成小段。檢測肽段)
(2)空間結(jié)構(gòu)測定:蛋白空間結(jié)構(gòu)分析比一級結(jié)構(gòu)分析復(fù)雜得多。
方法:X射線衍射晶體分析法、核磁共振法等。
3. 功能的測定:
(1)酵母雙雜交(YTH):
假設(shè):欲檢測蛋白X與蛋白Y是否相互作用。
檢測方法:
將蛋白X與報告基因轉(zhuǎn)錄因子的BD融合;
將蛋白Y與AD融合;
確認(rèn)蛋白X與蛋白Y形成的復(fù)合體能否激活報告基因的表達(dá)。如果能激活報告基因的表達(dá),說明:X與Y形成了復(fù)合體,則BD和AD靠近,激活了下游報告基因的表達(dá);反之,報告基因不表達(dá)。
原理:
真核生物的轉(zhuǎn)錄因子(尤其是酵母轉(zhuǎn)錄因子GAL4),包括兩個彼此分離、但功能必需的結(jié)構(gòu)域:一個是與DNA結(jié)合的結(jié)構(gòu)域-BD;一個是轉(zhuǎn)錄激活域-AD。BD識別轉(zhuǎn)錄因子效應(yīng)基因的上游序列并與之結(jié)合;AD通過與轉(zhuǎn)錄復(fù)合體的其他成分作用,啟動下游的基因轉(zhuǎn)錄。
即使BD與AD分開,但如果在空間上較為接近時也能激活轉(zhuǎn)錄。——利用轉(zhuǎn)錄因子的BD、AD這一特性,通過檢測轉(zhuǎn)錄因子是否啟動了其效應(yīng)基因的表達(dá),可研究蛋白質(zhì)X與Y是否相互作用。
(2) 蛋白質(zhì)芯片技術(shù):一種高通量、微型化、自動化的蛋白質(zhì)分析技術(shù)。一次試驗中可同時檢測幾百甚至幾千種目標(biāo)蛋白或多肽。
(3)免疫印跡技術(shù) Western blotting:利用抗原抗體特異反應(yīng)的原理。
用途:檢測樣品中特定蛋白質(zhì)是否存在以及半定量分析、研究蛋白質(zhì)間的相互作用。